(Autor: Prof. univ. dr. ing. Maria Turtoi-Universitatea Dunărea de Jos din Galaţi) Coagularea laptelui cu proteaze din plante fie ca extracte brute, fie sub formă purificată este cunoscută de secole în multe părţi ale globului. Aceste enzime sunt o alternativă pentru cheagul de viţel care are disponibilitate limitată şi preţ ridicat. Se găsesc în aproape toate tipurile de ţesuturi vegetale şi pot fi obţinute din surse naturale sau cultivare in vitro. Aproape toate enzimele utilizate pentru coagularea laptelui aparţin proteazelor aspartice dar există şi alte enzime cu capacitate coagulantă, în condiţii corespunzătoare, precum cistein şi serin proteaze. Utilizarea proteazelor din plante la fabricarea brânzeturilor este limitată din cauza productiei mai scăzute de brânză, aromelor mai amare şi defectelor de textură.   Milk coagulation with plant proteases   Milk coagulation with plant proteases either as crude extracts or purified form has been known for centuries in many parts of the world. These proteases are an alternative to the calf rennet which has limited availability and high price. They are found in virtually all kind of plant tissues, and can be obtained from natural sources or in vitro culture. Almost all enzymes used for milk clotting belong to aspartic proteases but there are other enzymes such as cistein and serin proteases which are capable to clot the milk under appropriate conditions. The use of plant proteases in the manufacture of cheese is limited due to lower yields of cheese, bitter flavour and texture defects.   Enzime proteolitice Proteazele sunt acele enzime care efectuează proteoliza, începând catabolismul proteic prin hidroliza legăturilor peptidice dintre aminoacizii din structura lanţului polipeptidic care alcătuiesc proteina. De-a lungul timpului, au evoluat de mai multe ori astfel că aceeaşi reacţie poate fi efectuată de clase diferite de proteaze prin mecanisme catalitice complet diferite. Sunt clasificate, în funcţie de restul catalitic, în următoarele grupe: serin proteaze, treonin proteaze, cistein proteaze, aspartat proteaze, proteaze ale acidului glutamic şi metaloproteaze.     Proteazele se găsesc în toate organismele, de la procariote la eucariote şi virusuri. Aceste enzime sunt multifuncţionale, având multe funcţii fiziologice în plante şi animale. Astfel, sunt implicate în reacţii fiziologice diverse de la simpla digestie a proteinelor din alimente la reacţii în cascadă extrem de bine reglate precum coagularea sângelui sau apoptoza. Intervin, de asemenea, în germinare, îmbătrânire biologică, procese inflamatorii etc. Proteazele acţionează fie descompunând complet o peptidă în aminoacizi (proteoliză nelimitată), fie rupând legăturile peptidice specifice (proteoliză limitată) în funcţie de secvenţa de aminoacizi care alcătuiesc proteina. Activitatea poate fi o modificare distructivă precum suprimarea funcţiei unei proteine sau digestia proteinei până la aminoacizi sau poate fi o activare a unei funcţii, respectiv un semnal într-o cale de semnalizare. Unele enzime au o activitate proteolitică eterogenă şi dezordonată, fiind capabile să hidrolizeze o gamă largă de substraturi proteice. Aşa sunt enzimele digestive, de exemplu tripsina care trebuie să fie capabilă să scindeze mulţimea de proteine din hrana ingerată în fragmente peptidice mai mici. În schimb, alte proteaze au specificitate ridicată şi scindează substraturi care conţin numai o anumită secvenţă. Aşa este trombina, o peptidă implicată în coagularea sângelui. Proteazele au un rol comercial important în industriile alimentară, textilă şi de prelucrare a pielii. Ele reprezintă mai mult de 60% din totalul enzimelor comercializate pe piaţă.   Coagularea laptelui   Coagularea laptelui este etapa principală a producerii brânzeturilor. Se realizează cu enzime de coagulare care sunt preparate de enzime proteolitice, aceasta fiind cea mai veche aplicaţie a enzimelor, cunoscută de mii de ani. Din punct de vedere istoric, cheagul extras din stomacul rumegătoarelor este cea mai folosită sursă de enzime la fabricarea brânzeturilor, cu toate că există dovezi ale utilizării timpurii a enzimelor de coagulare din microorganisme şi plante. Cheagul este un complex de enzime produse în stomacul oricărui mamifer, printre care proteaze care coagulează laptele, producând separarea acestuia într-o parte solidă (coagul) şi una lichidă (zer). Prezenţa acestor enzime este foarte importantă în stomacul mamiferelor tinere pentru digerarea laptelui matern cu care sunt alăptate. Principala enzimă activă din cheag se numeşte chimozină sau renină (CE 3.4.23.4), alături de ea existând pepsină şi lipază.     Cheagul natural de viţel este extras din mucoasa interioară a celei de a patra camere a stomacului viţeilor tineri, neînţărcaţi. Cheagul extras de la viţei în vârstă, hrăniţi cu iarbă sau cu cereale, conţine mai puţină chimozină sau chiar deloc, dar mai multă pepsină. Acest cheag poate fi folosit doar pentru unele tipuri speciale de lapte şi brânzeturi. Fiecare specie de rumegătoare produce un tip special de cheag pentru a digera laptele propriei specii, astfel că există, spre exemplu, cheag de ied pentru coagularea laptelui de capră sau cheag de miel pentru coagularea laptelui de oaie.   Alternative pentru cheag Producţia de brânzeturi a crescut de aproximativ 3,5 ori din 1961, în timp ce disponibilitatea cheagului a scăzut din cauza reducerii sacrificării viţeilor neînţărcaţi, crescătorii preferând creşterea lor pentru a asigura carne pentru consum. La aceasta se adaugă preţul mare al cheagului, restricţiile religioase şi reglementările etnice faţă de folosirea secreţiilor animale în hrană (de exemplu în iudaism şi islamism), respectiv dieta vegetariană sau interdicţia de utilizare a cheagului de viţel recombinat (în Franţa, Germania şi Olanda). Toţi aceşti factori au contribuit la căutarea altor surse de enzime cu potenţial de coagulare a laptelui în afara celor deja cunoscute. Există multe surse alternative de enzime coagulante, plante şi microorganisme, care pot substitui cheagul animal. Chimozina produsă prin fermentare (fermentation produced chimosin, FPC) este utilizată în special la fabricarea brânzeturilor în America de Nord şi în Europa fiindcă este mai ieftină şi are o calitate mai bună decât cheagul animal. Enzimele produse de microorganisme sunt potrivite ca înlocuitori de cheag însă a crescut mult interesul pentru enzime de coagulare extrase din plante.     Aceste enzime sunt prezente în aproape toate tipurile de ţesuturi vegetale şi se pare că toate enzimele proteolitice au capacitatea de a coagula laptele în condiţii corespunzătoare. Aproape toate enzimele utilizate pentru coagularea laptelui aparţin proteazelor aspartice dar sunt folosite şi enzime din alte grupe precum cistein şi serin proteazele. Extractele de plante au fost folosite din timpuri străvechi la coagularea laptelui pentru obţinerea brânzei, în special în ţări mediteraneene, din vestul Africii şi din sudul Europei. Astfel, Homer a sugerat, în Iliada şi Odiseea, că grecii coagulau laptele cu ajutorul unui extract de smochine. Spania şi Portugalia au cea mai mare varietate de brânzeturi obţinute cu enzime de coagulare din ciulini (Cynara sp.): brânzeturile Los Pedroches, La Serena, Torta del Casar (din lapte de oaie), Los Ibores (din lapte de capră) şi Fluor de Guia (dintr-un amestec de lapte de oaie şi de vacă) în Spania şi brânzeturile Serra şi Serpa în Portugalia. De asemenea, extractele din mărul Sodomei (Calotropis procera) au fost folosite la fabricarea brânzeturilor în ţări din vestul Africii precum Nigeria şi Republica Benin.   Cercetările din ultimele decenii au lărgit lista plantelor sau a unor părţi din plante care conţin enzime cu proprietăţi de coagulare a laptelui: acid fitic obţinut din boabe de soia nefermentate, aloe (Aloe vera), ananas (Ananas comosus), buruiana şarpelui (Euphorbia hirta), castravete (Cucumis sativus), ciulini (familia Asteraceae, Cynara cardunculus), dovleac (Cucurbita maxima), frunze de urzici (Urtica dioica), frunze sau flori ale mărului Sodomei (Calotropis procera), frunze uscate de capere (Capparis spinosa), gălbenele europene semiacvatice (Ranunculus ligua), iederă pitică (Glechoma hederacea), latex uscat de papaya (Carica papaya), măcriş (măcriş franţuzesc, Rumex scutatus, măcriş comun, Rumex acetosa sau măcrişul oilor, Rumex acetosella), nalbă (Althaea officinalis), pepene galben de iarnă (Benincasa cerifere), oua-soarelui (Drosera rotundifolia), sânziene (Galium verum), seminţe de moringa (Moringa oleifera), seminţe de ricin (Ricinis communis), smochin comun (Ficus carica), withania (Withania coagulans sau Withania somnifera) etc. În tabelul 1 sunt prezentate câteva exemple de plante din care se extrag proteaze pentru care se cunosc activitatea de coagulare a laptelui şi activitatea proteazei în unităţi/ml. Brânzeturile produse cu oricare din aceste enzime sunt adecvate pentru lacto-vegetarieni. De asemenea, proteazele vegetale pot fi utilizate pentru producerea brânzeturilor kosher şi halal cu toate că în prezent, la nivel mondial, aproape toate brânzeturile kosher sunt obţinute fie cu proteaze mirobiene, fie cu cheag produs prin fermentare. Preparatele comerciale conţin, de obicei, proteaze sintetizate de Mucor miehei.  

Tabelul 1. Conţinutul de proteine, activitatea de coagulare şi activitatea proteazei în câteva plante