(Autor: Prof. univ. dr. ing. Maria TURTOI Universitatea Dunărea de Jos din Galaţi) Queijo Prato este un sortiment de brânză din Brazilia care este similar, la origini, brânzei daneze Danbo, fiind introdusă de imigranți danezi în statul Minas Gerais. Întrucât metoda inițială de obţinere a fost asemănătoare cu cea a brânzei Danbo, diferențele dintre aceste brânzeturi sunt atribuite în special caracteristicilor laptelui. Brânza Prato are un conţinut scăzut de sare şi lactoză, culoare galbenă şi miros specific moderat. Se obţine din lapte de vacă pasteurizat prin coagulare enzimatică atât cu chimozină din cheag, cât şi cu proteaze fungice.   Obţinerea tradiţională a brânzei Prato Queijo Prato este cel mai popular sortiment de brânză din Brazilia (queijo = brânză în limba portugheză). Sunt cunoscute cinci varietăți: Minilanche, Lanche, Coboco, Prato și Estepe. Diferențele dintre varietăți se referă la forma, masa și durata de maturare a unei bucăţi. Bucățile de brânză sunt paralelipipedice, cubice sau cilindrice, cântăresc 0,4-6 kg și sunt maturate timp de 16-60 zile. Brânza Prato este un sortiment de brânză maturată semitare (conţinut de umiditate 36-45,9 %), opărită la temperatură scăzută (≈ 42°C), fabricată prin coagularea enzimatică a laptelui şi maturată cel puţin 25 de zile. Este obţinută industrial din lapte de vacă integral după o tehnologie care pare a fi o adaptare a celei utilizate pentru brânzeturile Edam sau Gouda. Laptele standardizat cu un conţinut de grăsime de 3,5 % este pasteurizat şi răcit la 32°C. Se adaugă clorură de calciu și azotat de sodiu, precum și colorant, respectiv cultură lactică. La coagularea cu cheag comercial, durata de obţinere a coagulului este de 45 până la 60 min. Coagulul se taie în cuburi de 0,5 cm și se amestecă încet timp de 20 min. Jumătate din zer se evacuează și se continuă agitarea. Se adaugă apă caldă  de 90...95°C pentru a ridica temperatura amestecului de coagul şi zer la 40...42° C. Boabele de caș trebuie să rămână împreună atunci când se apasă şi să formeze fire la separare. Urmează a doua scurgere a zerului după care cașul este presat timp de circa 20 min. Apoi cașul se taie în bucăți de dimensiuni corespunzătoare matrițelor, se introduce în matrițe și este presat timp de 30-40 de minute, întors în matrițe și presat din nou timp de până la 12 ore. Bucățile de brânză sunt scoase din matrițe și sărate în saramură la 5...15°C timp de până la 36 h. La final sunt scoase din saramură și lăsate să se scurgă la aceeași temperatură timp de până la 48 de ore înainte de ambalare în folie de plastic.   Coagularea enzimatică a laptelui Coagularea enzimatică a laptelui pentru fabricarea brânzei implică modificări specifice ale micelei de cazeină prin proteoliza limitată realizată de proteinaze selectate, urmată de agregarea micelară în prezența calciului. Cheagul, alcătuit în mare parte din chimozină (EC 3.4.23.4, pHi ≈ 4,65) este proteaza cea mai utilizată pentru fabricarea brânzeturilor. Procesul de coagulare enzimatică a laptelui se desfășoară în două etape: primară, pur enzimatică şi secundară, neenzimatică, în care se formează gelul şi care nu poate avea loc decât după etapa primară. Etapa primară a coagulării enzimatice este foarte rapidă şi constă în hidroliza κ-cazeinei, fracţiunea stabilizatoare a micelei coloidale de cazeină, la nivelul legăturilor foarte labile Phe105-Met106. Această hidroliză distruge stabilitatea micelară, lanţul peptidic fiind scindat în două fragmente. Partea N-terminală a moleculei, fragmentul para-κ-cazeina, care cuprinde resturile de aminoacizi 1-105, rămâne atașată de micela de cazeină, solubilă şi cu caracter bazic. Partea C-terminală, cunoscută sub numele de glicomacropeptidă (GMP), alcătuită din resturile de aminoacizi 106-169, este solubilă în mediul apos şi acidă, astfel că se elimină prin zer. Etapa secundară corespunde fenomenului de coagulare propriu-zisă a laptelui. Modificările fizico-chimice ale micelelor continuă în această fază. Îndepărtarea fragmentului GMP rezultat din hidroliza κ-cazeinei în prima etapă reduce sarcinile negative ale micelei şi gradul de hidratare prin pierderea părții hidrofile. Aceasta face posibilă agregarea micelelor de para-κ-cazeină în prezenţa Ca2+, la temperaturi de peste 15...20°C, cu formarea unui gel la final, cu condiţia ca laptele să nu fie agitat. Agregarea sau flocularea este datorată în parte forțelor de atracție van der Waals, însă acest efect este insuficient. Prezenţa Ca2+ este necesară întrucât acești ioni neutralizează sarcinile electrice negative ale micelelor, deci reduc respingerea electrostatică. În limitele de pH din lapte, ionii de Ca2+ acţionează mai eficient decât ionii H+. În plus, ionii Ca2+ pot realiza legături saline (punți) între locurile încărcate negativ din micelele de para-κ-cazeină în plus faţă de punțile care se pot forma între locurile pozitive şi negative. Gelul obţinut este o matrice de proteine denumită şi coagul. El este un sistem complex cu o structură fizică instabilă, în reţeaua proteică fiind încorporate zerul (apa şi componentele solubile din lapte), grăsimea şi celulele microbiene. O parte importantă din zer este eliminată spontan, concomitent cu contractarea şi întărirea coagulului. Tratarea în continuare a coagulului permite obţinerea marii varietăți de brânzeturi în funcţie de tratamentul urmat.   Înlocuitori de chimozină Înlocuitorii de chimozină trebuie să reproducă proprietățile specifice ale chimozinei, adică să prezinte activitate mare de coagulare a laptelui care constă în a avea specificitate pentru κ-cazeină și activitate proteolitică redusă la valori de pH și temperatură utilizate în mod normal în fabricarea brânzei. În prezent, se utilizează chimozină obţinută prin fermentare, chimozină pură obţinută prin utilizarea unui organism gazdă şi coagulanți obținuți din microorganisme precum Rhizomucor miehei, Rhizomucor pusillus, Endothia parasitica, Aspergillus oryzae și Irpex lacteus. Dintre coagulanții microbieni disponibili comercial, cei mai utilizaţi sunt cei din surse fungice. Creşterea potenţialului de producere, comercializare şi utilizare a enzimelor microbiene a generat studii numeroase care au descoperit proteaze noi sintetizate de microorganisme precum Novocardiopsis spp, Rhizopus oryzae, Mucor bacilliformis, Bacillus subtilis natto şi Thermomucor indicae-seudaticae N31.   Brânză Prato obţinută cu enzime microbiene Câteva cercetări recente au urmărit obţinerea brânzei Prato folosind ca enzime de coagulare proteaze obţinute din mucegaiul termofil T. indicae-seudaticae N31 izolat în Brazilia din deşeuri industriale (Martin et al., 2010, Microbiology, vol. 79, pp. 306-313). Extractul enzimatic a fost obţinut prin fermentare în stare soldă, folosind numai tărâțe de grâu ca substrat. Enzima secretată extracelular în 24 ore de fermentare are o activitate maximă de coagulare a laptelui la pH = 5,7 şi 70°C, respectiv stabilitate în domeniile de pH 3,5-4,5 şi 5,0-6,0 şi în domeniul de temperatură 35...40-45°C. De asemenea, profilul peptidelor formate de enzimele din T. indicae-seudaticae N31 a fost asemănător cu cel produs de enzimele din R. miehei. De asemenea, Merhed-Dini et al. (2012, Food Chemistry, vol. 120, pp. 87-93) au arătat că profilul peptidelor obţinut cu proteaze produse de T. indicae-seudaticae N31 şi de R. miehei este asemănător. Comparația între brânza Prato obţinută cu aceste enzime şi cu chimozina HA-LA produsă prin fermentație de Christian Hansen Brazilia sugerează posibilitatea obţinerii unor produse cu o calitate tehnologică bună. Alves et al. (2013, Journal of Dairy Science, vol. 96, pp. 7490-7499) au obţinut, la scară pilot, brânză Prato cu ajutorul enzimei sintetizate rapid de T. indicae-seudaticae N31 pe un substrat ieftin şi au comparat-o cu o protează comercială cunoscută, produsă de Rhizomucor spp. şi utilizată de obicei pentru obţinerea brânzei Prato. Pentru o caracterizare cât mai completă au fost determinate compoziţia brânzei şi a zerului, conţinutul de proteine şi de grăsimi reținute în coagul şi randamentul în brânză. Aceşti parametri nu au fost afectați de tipul de enzimă de coagulare utilizat. De asemenea, s-a efectuat analiza senzorială, iar proteoliza, fermitatea brânzei şi degradarea cazeinei au fost monitorizate pe parcursul perioadei de depozitare la 12°C pentru maturare, probele prelevate după 5, 12, 19, 33, 43 şi 53 de zile de depozitare fiind analizate prin electroforeză capilară. Proteoliza a crescut, iar fermitatea a scăzut pentru ambele brânzeturi în timpul depozitării, cum era de așteptat pentru brânză Prato. Cazeina a fost bine separată prin electroforeză capilară și rezultatele au arătat, cu rezoluție bună, că brânzeturile au prezentat profiluri similare pentru hidroliza proteinelor. Analiza senzorială a fost efectuată după 29 zile de la fabricaţie, pentru ambele brânzeturi obţinându-se o acceptabilitate senzorială bună. Datele obţinute au arătat că proteaza produsă de T. indicae - seudaticae N31 a prezentat acţiuni similare cu enzima comercială, ceea ce indică eficienţa sa ca agent de coagulare pentru producţia brânzei Prato. Studiile prezentate reprezintă o contribuţie deosebită în tehnologia brânzeturilor prin faptul că urmăresc punerea în aplicare a unei noi enzime microbiene pentru producerea brânzei.